L’essentiel de Biochimie structurale en PASS

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9 cours90 points clés

03-01 · partie 1Eau, interactions et acides aminés

L'eau est polaire et peut donner ou accepter des liaisons hydrogène ; autour d'un ion, les dipôles s'orientent et forment une sphère d'hydratation dynamique.
L'effet hydrophobe favorise l'association de surfaces apolaires dans certaines conditions aqueuses ; ce n'est pas une liaison covalente supplémentaire entre carbones.
Un acide aminé alpha a un carbone central portant amino, carboxyle, hydrogène et chaîne latérale R ; la glycine a R = H et n'est pas chirale.
À pH intermédiaire, un acide aminé simple porte souvent COO− et NH3+ : c'est une forme zwitterionique, donc charge nette nulle ne signifie pas absence de charges locales.
Asp et Glu sont acides et fréquemment négatifs vers pH neutre ; Asn et Gln portent des amides, contrairement aux carboxylates, et Met ne forme pas les ponts disulfure de Cys.
Pour un acide HA, fraction déprotonée ≈ 1/[1 + 10^{pKa − pH}] ; à pH = pKa chaque forme est moitié, mais dans une protéine voisinage, enfouissement et liaisons hydrogène peuvent déplacer un pKa.
Lors d'une liaison peptidique, carboxyle et amino deviennent amide ; pour un peptide linéaire non modifié, on compte extrémité N, extrémité C et chaînes latérales ionisables.
Pour déterminer un pI, on identifie les deux pKa encadrant la forme de charge nette nulle ; le pI n'est pas la moyenne de tous les pKa présents.
Une acétylation N-terminale, une amidation C-terminale ou une phosphorylation modifient les groupes titrables et donc la charge ; un peptide N-acétylé n'a plus le même amino terminal libre.
Au-dessus du pI, la charge moyenne est généralement négative et favorise un déplacement vers l'anode positive ; au-dessous, vers la cathode négative.

03-01 · partie 2Architecture, repliement et fonction des protéines

La liaison peptidique a un caractère partiellement double, le motif est coplanaire, et les rotations du squelette se font autour des liaisons adjacentes au carbone alpha.
Structure primaire : séquence et connexions covalentes ; secondaire : motifs locaux ; tertiaire : organisation tridimensionnelle d'une chaîne ; quaternaire : association de plusieurs chaînes.
L'hélice alpha est stabilisée par des liaisons hydrogène du squelette entre C=O du résidu i et N-H du résidu i+4, avec environ 3,6 résidus par tour.
Dans un feuillet bêta, les brins sont reliés par des liaisons hydrogène du squelette et les chaînes latérales alternent de part et d'autre ; les brins peuvent être parallèles ou antiparallèles.
Le repliement résulte d'un paysage énergétique ; l'effet hydrophobe enfouit les groupes apolaires et les chaperonnes limitent les interactions inappropriées, certaines consommant de l'ATP.
Deux cystéines peuvent former un pont disulfure covalent par oxydation de leurs thiols ; les ponts salins sont des interactions électrostatiques, à ne pas confondre.
La dénaturation altère les interactions stabilisant la conformation sans hydrolyser obligatoirement les liaisons peptidiques ; la structure primaire peut rester intacte alors que l'activité disparaît.
L'hémoglobine présente une coopérativité positive avec une courbe de saturation sigmoïde, tandis que la myoglobine monomérique donne une courbe hyperbolique sans coopérativité entre sous-unités.
Pour un site indépendant, θ = [L]libre/(Kd + [L]libre) ; à [L] = Kd la moitié des sites est occupée, et Kd se distingue du Km enzymatique.
Déplier n'est pas dissocier : une protéine tétramérique peut se dissocier en sous-unités partiellement repliées, et les niveaux tertiaire et quaternaire ne disparaissent pas nécessairement ensemble.

03-01 · partie 3Globines et fixation de l’oxygène : structure, équilibre et coopérativité

L’hème comporte une porphyrine coordonnant un fer ferreux, lié aux quatre azotes du noyau et à une histidine proximale; l’histidine distale stabilise le ligand sans liaison directe.
La myoglobine est monomérique avec un hème et un site; l’hémoglobine A est un tétramère α2β2, chaque chaîne portant un hème, donc jusqu’à quatre O₂.
La fraction Y est le nombre moyen de sites occupés divisé par le nombre total de sites disponibles; Y=0,75 correspond à trois O₂ par tétramère si quatre sites fonctionnels.
Pour P + O₂ ⇌ PO2, Kd=[P][O₂]/[PO2] et Y=[O₂]/(Kd+[O₂]); à [O₂]=Kd, Y=1/2; on écrit aussi Y=p/(P50+p).
Une P50 plus faible signifie une demi-saturation atteinte à plus faible pression, donc une affinité apparente plus élevée dans ces conditions.
Dans une coopérativité positive, la fixation de ligand modifie les probabilités de fixation aux autres sites; T et R représentent des populations d’affinité plus faible et plus élevée.
L’équation de Hill Y=p^n/(P50^n+p^n) a n contrôlant la pente; n=1 redonne l’hyperbole à un site, n>1 décrit une coopérativité positive, mais n n’est pas le nombre de sites.
Effet Bohr: baisse du pH réduit l’affinité de l’hémoglobine pour O₂, P50 augmente; CO₂ agit par équilibres acido-basiques et carbamates; effet Haldane concerne oxygénation sur CO₂ et protons.
Le 2,3-BPG, métabolite anionique des hématies, se fixe dans une cavité de l’hémoglobine désoxygénée et favorise une plus faible affinité pour O₂; il est hétérotrope.
Affinité, capacité et contenu lié sont distincts: contenu lié = capacité × saturation; même P50 et Y peuvent donner des contenus différents si la concentration en hémoglobine diffère.

03-02 · partie 1Structure et reconnaissance des glucides

Un ose possède plusieurs groupes hydroxyle et un carbonyle sous forme ouverte ; un aldose porte un aldéhyde, un cétose une cétone.
La série D ou L se définit par la configuration du centre de référence le plus éloigné du carbonyle en projection de Fischer, sans donner le signe de rotation optique.
La cyclisation forme un hémiacétal ou hémicétal : le cycle pyranose a six atomes, le furanose cinq, et le carbone anomérique est C1 pour un aldose, C2 pour un cétose.
Si le carbone anomérique porte un OH hémiacétal libre, le cycle s'ouvre et se referme : les anomères s'interconvertissent par mutarotation, modifiant la rotation optique mesurée.
Une liaison glycosidique engage le carbone anomérique et forme un acétal ; un disaccharide reste réducteur si au moins un carbone anomérique pertinent demeure libre.
Le maltose et le lactose possèdent une extrémité réductrice ; dans le saccharose, les deux centres anomériques sont engagés, donc il est non réducteur dans les tests usuels.
Le glycogène possède des liaisons alpha(1→4) et des branches alpha(1→6) ; ses nombreuses extrémités non réductrices permettent une mobilisation simultanée par plusieurs enzymes.
La cellulose possède des liaisons bêta(1→4) entre unités de glucose ; la différence alpha/bêta change la géométrie et la reconnaissance enzymatique, donc la digestion humaine diffère.
Dans le D-glucose de Fischer, CHO est en haut, les OH de C2, C3, C4 et C5 sont droite, gauche, droite, droite ; le D vient de C5.
Dans la Haworth standard du D-glucopyranose, l'OH anomérique alpha est opposé au CH2OH de référence, donc vers le bas ; bêta est du même côté, vers le haut.

03-02 · partie 2Lipides et organisation des membranes

Un acide gras saturé n'a pas de double liaison carbone-carbone ; un insaturé en possède une ou plusieurs, et les doubles liaisons cis créent des coudes gênant l'empilement.
La notation 18:1 indique dix-huit carbones et une double liaison ; la notation delta compte depuis le carboxyle, la notation oméga depuis l'extrémité méthyle.
Un triacylglycérol est un glycérol estérifié par trois acides gras ; globalement apolaire, il forme des réserves peu hydratées et n'est pas un constituant typique de la bicouche.
Un glycérophospholipide comprend deux chaînes acyles, un glycérol, un phosphate et une tête polaire ; phosphatidylcholine, phosphatidyléthanolamine et phosphatidylsérine diffèrent par cette tête.
Un sphingolipide repose sur une base sphingoïde ; le céramide associe cette base à un acide gras par une liaison amide, donc tous les lipides membranaires n'ont pas de squelette glycérol.
Le cholestérol est amphiphile : son OH se place près des têtes polaires et son noyau rigide s'insère parmi les chaînes ; son effet sur la fluidité dépend de la température.
Les molécules amphiphiles exposent leurs parties polaires à l'eau ; les lipides à deux chaînes favorisent souvent des bicouches, et une bicouche peut se refermer en vésicule.
La membrane est dynamique : diffusion latérale et rotations sont possibles, mais le flip-flop spontané d'un phospholipide est beaucoup plus lent et peut nécessiter des protéines.
Les petites molécules apolaires traversent plus facilement le cœur lipidique que les ions, fortement hydratés, qui doivent payer un coût énergétique élevé ; canaux et transporteurs offrent des voies adaptées.
En FRAP, la fraction mobile apparente se calcule par (plateau moins valeur après blanchiment) divisé par (avant moins après blanchiment), soit 48/80 = 60 %.

03-02 · partie 3Nucléotides, vitamines et coenzymes

Une base azotée associée à un pentose forme un nucléoside ; l'ajout d'un ou plusieurs phosphates forme un nucléotide, donc adénine et adénosine ne sont pas synonymes.
Les purines comprennent adénine et guanine ; les pyrimidines comprennent cytosine, thymine et uracile ; le ribose a un OH en 2′ absent du désoxyribose.
Dans les acides nucléiques, des liaisons phosphodiester relient les positions 3′ et 5′, et la séquence se lit conventionnellement 5′ vers 3′.
L'ATP comprend adénine, ribose et trois phosphates ; les deux liaisons entre phosphates sont phosphoanhydride et la liaison au ribose est phosphoester.
Un cofacteur non protéique est nécessaire à certaines enzymes ; un coenzyme est organique, cosubstrat ou groupe prosthétique ; l'apoenzyme en est privé et l'holoenzyme est l'ensemble fonctionnel.
Une vitamine est un composé organique nécessaire en petites quantités que l'organisme ne synthétise pas suffisamment dans les conditions considérées.
NAD+ accepte un hydrure et devient NADH ; NADP+ possède un phosphate supplémentaire qui modifie surtout la reconnaissance enzymatique, sans apporter un électron de plus.
FAD, issu de la riboflavine, peut participer à des transferts d'un ou deux électrons selon le contexte et est souvent étroitement associé à l'enzyme.
La CoA porte un thiol permettant la formation de thioesters et transporte des groupes acyle ; suivre le groupe effectivement transféré est plus instructif que mémoriser le nom du coenzyme.
Le PLP forme une liaison imine et stabilise des intermédiaires ; la biotine active le CO₂ ; les folates transportent des unités à un carbone ; la B12 intervient dans des réactions spécifiques.

03-03 · partie 1Catalyse et cinétique enzymatique

Une enzyme augmente la vitesse d'une réaction en abaissant sa barrière d'activation par un chemin catalytique, sans changer l'équilibre thermodynamique.
Dans le modèle de Michaelis-Menten, v0 = Vmax[S]/(Km + [S]), avec Vmax = kcat[E]tot et Km = (k−1 + kcat)/k1.
La définition robuste de Km est que [S] = Km donne v0 = Vmax/2 dans ce modèle, et non une mesure universelle d'affinité.
Si [S] est très inférieure à Km, v0 ≈ (Vmax/Km)[S] ; si [S] est très supérieure à Km, v0 approche Vmax.
À [S] = 9Km, v0 = 0,90Vmax ; à 99Km, v0 = 0,99Vmax, la saturation étant asymptotique sans atteinte exacte de Vmax.
Doubler la quantité d'enzyme double Vmax et la vitesse à [S] fixé, si le substrat reste disponible, sans changer Km.
kcat exprime le nombre de transformations par site actif et par unité de temps à saturation, en s^-1, tandis que kcat/Km caractérise l'efficacité à faible [S].
Un dosage suit une région linéaire où substrat, pH et enzyme restent suffisamment constants, et Beer-Lambert donne dc/dt = (1/εl)dA/dt.
Un dosage couplé doit utiliser une réaction auxiliaire assez rapide et non limitante pour que le signal reflète l'enzyme étudiée.
La double réciproque amplifie les erreurs aux faibles concentrations ; des contrôles sans enzyme, sans substrat et plusieurs quantités d'enzyme vérifient le dosage.

03-03 · partie 2Inhibition et régulation enzymatiques

Inhibition compétitive : l'inhibiteur se fixe à l'enzyme libre, le Km apparent augmente (α = 1 + [I]/Ki) et Vmax reste inchangée.
Inhibition incompétitive : l'inhibiteur se fixe à ES ; Km apparent et Vmax apparent diminuent dans la même proportion.
Non compétitive pure (α = α′) : Vmax diminue et Km reste inchangé ; mixte : Vmax apparent = Vmax/α′ et Km apparent = αKm/α′.
Un inhibiteur irréversible réduit durablement la quantité de sites fonctionnels, souvent par liaison covalente ; dilution ou dialyse aident à distinguer réversible et durable.
Un effecteur allostérique se lie à un site couplé au site fonctionnel ; une courbe sigmoïde suggère une coopérativité, on utilise alors S0,5 ou K0,5.
Le coefficient de Hill renseigne sur la pente et la coopérativité apparente, mais ne donne pas le nombre exact de sous-unités ni de sites.
La phosphorylation peut activer une enzyme et en inhiber une autre : il n'existe pas de règle universelle « phosphorylé = actif ».
Une protéolyse limitée convertit un zymogène en enzyme active ; elle est souvent irréversible au niveau de la molécule clivée.
L'IC50 dépend du substrat, du temps d'incubation et de la quantité d'enzyme ; en compétitif simple, IC50 = Ki(1 + [S]/Km).
Inhibiteur serré : si sa concentration est proche de celle de l'enzyme, la concentration libre n'égale plus la concentration ajoutée et les équations usuelles doivent être adaptées.

03-03 · partie 3Séparer, quantifier et tester des biomolécules

Distinguer quantité, pureté, identité et fonction est essentiel ; une bande nette n’établit pas à elle seule toutes ces propriétés.
L’extraction doit préserver la propriété étudiée ; des détergents forts peuvent dénaturer et les protéases de l’extrait peuvent dégrader la cible.
L’exclusion stérique sépare selon le volume hydrodynamique apparent ; les grosses particules éluent souvent plus tôt et la masse estimée n’est pas toujours exacte.
L’échange d’ions utilise la charge nette ; une résine positive retient des espèces négatives et le nom échangeur d’anions désigne une phase à charges positives.
En SDS-PAGE, le détergent dénature et confère une charge négative proportionnelle à la longueur ; la migration dépend surtout de la taille des chaînes.
L’activité spécifique est l’activité totale divisée par la masse totale de protéines ; elle augmente souvent lorsque les contaminants sont retirés.
Un western blot détecte une cible reconnue par un anticorps ; une bande à la taille attendue soutient une identification mais ne l’établit pas seule.
Dans un tableau de purification, les rendements des étapes se multiplient et ne s’additionnent pas : 80 % × 62,5 % = 50 %.
Un rendement apparent supérieur à 100 % ne prouve pas une création de molécules ; il peut résulter d’une inhibition levée ou d’une interférence du dosage.
Une masse native de 120 kDa, 60 kDa en SDS non réducteur et 30 kDa en réducteur suggère un tétramère de quatre chaînes de 30 kDa en deux dimères disulfure.

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